|
|
Úloha izoenzymů v regulaci metabolismu sinic
BACHHAR, Anushree
Modelová sinice Synechocystis PCC 6803 je jedním z nejstudovanějších druhů sinic, který má významný podíl v biotechnologických aplikacích, což vysvětluje, proč se jí také říká "zelená E. coli". Experimentální studie mohou poskytnout in vitro charakterizaci isozymů, ale nikdo neví, zda a jak přesná je taková parametrizace ve srovnání se stavem in vivo. Také navzdory studiím s jedním/mnoha mutanty, stále plně neznáme rozsah rolí izoenzymů. Důvody, které stojí za tímto problémem, jsou: i) vyřazení jednoho izozymu je pravděpodobně kompenzováno zbývajícími izozymy, ii) deaktivace všech izozymu nepočítá s neznámou multifunkčností jiných enzymů nebo iii) metabolická plasticita Synechocystis umožňuje přesměrování metabolického toku na alternativní dráhy v rámci centrálního metabolismu uhlíku, např. prostřednictvím glykolytických drah (Embden-Meyerhof-Parnasova dráha, Entner-Doudorova dráha, fosfoketolázová dráha a oxidativní pentózofosfátová dráha). V této studii jsem se zaměřila na rozluštění některých regulačních mechanismů v rámci centrálního metabolismu uhlíku Synechocystis s pomocí metabolického modelu, který integruje fluxomické, metabolické a transkriptomické údaje z literatury a různých databází, např. Uniprot, KEGG. V první polovině svého doktorského výzkumu jsem se zaměřila na vliv většinou opomíjené glykolytické fosfoketolázové dráhy. Zejména jsme ukázali, že tok uhlíku cestou fosfoketolázy může dosáhnout 250 % toku přes Embden-Meyerhof-Parnas glykolýzu za autotrofních podmínek a úrovně CO2 okolního prostředí. Tedy, fosfoketolázová dráha hraje klíčovou roli tím, že zmírňuje dekarboxylaci, tj. ztráty uhlíku, ke kterým dochází v ostatních glykolytických cestách. Dále jsme předpověděli, že role fosfoketolázové dráhy za mixotrofních podmínek je u Synechocystis spíše zanedbatelná, přestože je tato dráha klíčová u většiny bakterií za heterotrofních podmínek. Kromě toho jsme potvrdili existenci předpokládaného izoenzymu fosfoketolázy (PKET 2) a kvantifikovali následující výsledky za autotrofních podmínek a úrovně CO2 okolního prostředí: 1) 17% snížení toku přes RuBisCO pro delta pket1 a 2) 11,2-14,3% snížení růstu pro delta pket2 v turbulentním prostředí a 3) preference substrátů pro fosfoketolázovou dráhu za daných růstových podmínek. V druhé polovině své výzkumné práce jsem se zaměřila na nedávno potvrzenou glykolytickou Entner-Doudoroffovu dráhu u Synechocystis. Entner-Doudoroffova dráha byla dříve považována za velmi běžnou (~92 %) mezi sinicemi, ale moje bioinformatická analýza na základě dostupných zdrojů dat předpověděla, že výskyt Entner-Doudoroffovy dráhy je nižší než 50 %. Zajímavé je, že jsme také identifikovali pravděpodobné izozymy v rámci Entner-Doudoroffovy dráhy u některých sinic. V případě Synechocystis jsme poskytli první odhad metabolického toku přes Entner-Doudoroffovu dráhu na základě údajů změn růstu při zablokování této dráhy; je zatím obtížné provést experimentální ověření s pomocí izotopu 13C vzhledem k současným limitům detekce velmi nízkých koncentrací metabolitů v přístrojích hmotnostní spektrometrie. Nicméně jsme zjistili příliš mnoho nejasností (multifunkčnost enzymů a problémy s identitou enzymů Entner-Doudoroffovy dráhy), takže je obtížné anotovat nebo předpovědět rozsah možných metabolických a regulačních funkcí Entner-Doudoroffovy dráhy u Synechocystis.
|
|
|
Biosynthesis of chlorophyll-binding proteins in cyanobacteria
BUČINSKÁ, Lenka
In oxygenic phototrophs, the photosynthetic machinery is located in thylakoid membrane (TM), a specialized endogenous membrane system. How TM are synthesized remains however mostly unknown. The aim of this thesis was to clarify a link between the synthesis of chlorophyll (Chl)-binding proteins, the main protein component of TM, and the formation of TM system in the model cyanobacterium Synechocystis PCC 6803. During the project, the analysis of TM under various growth conditions and in Chl-deficient mutants has demonstrated that a sufficient amount of de novo produced Chl molecules is crucial for the TM biogenesis. Particularly, the synthesis of the photosystem II subunit CP47 and trimeric photosystem I appeared to be sensitive to a shortage in de novo made Chl molecules. Interestingly, a specialized ribosome-binding protein (Pam68) has been identified to facilitate the insertion of Chl molecules into CP47. The synthesis of Chl-proteins and the biogenesis of TM have been further explored in cells recovering from long-term nitrogen depletion. Using this approach, it was possible to identify a large structure in the cell cytosol, which is very likely the site of TM biogenesis, and to correlate the appearance of this structure with the restored biogenesis of Chl-binding proteins.
|
host ::
RSS.